复发性流产遗传学研究

　　有大约40%～50%复发性流产（RSA)病因不明，研究发现其与遗传学有显著相关性。了解遗传学研究进展，为寻找复发性流产的病因提供新的思路，具有良好的临床意义。

　　复发性流产（recurrentspontaneousabortion，RSA)指与同一伴侣连续发生两次或两次以上自然流产[1]。流产是妊娠最常见的并发症，临床确定的妊娠发生自然流产的比例为10%～15%。有1/4的女性一生中至少经历过1次流产，且多发生于妊娠12周前，大于5%的夫妇发生过复发性流产。事实上，由于存在亚临床复发性流产及亚诊断复发性流产，其发病率可能更高[2]。除了物理创伤，流产尤其是复发性流产的夫妇承受了巨大的心理压力，其中1/3的患者有临床抑郁表现[3]，尽管RSA确定病因包括解剖学因素（15%），感染因素（1%～2%），激素改变（20%），免疫学因素（20%）及遗传学因素（2%～5%），这些因素可能通过抑制受精或阻止受精卵着床而不利于胚胎选择，但是仍有大约40%～50%患者病因不明，这些患者统称为不明原因的复发性流产（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA)[4]。有研究表明可能存在一种传统细胞遗传学分析方法不能发现的亚显微染色体改变导致流产的发生。随着分子生物学的发展，遗传学因素对RSA的影响研究显得尤为突出。本文就RSA与遗传学研究做一综述，更好的明确遗传背景的重要性，将有助于控制妊娠，预防妊娠并发症的发生。

　　RSA与双亲染色体核型关系

　　研究发现在我国普通人群中0．47％检测到染色体异常，在RSA患者中有3%～10%的夫妇发生染色体畸变，与普通人群相比，染色体异常率显著增高[5]。主要是相互易位（61％）和罗伯逊易位（16％），其他异常包括臂间倒位、臂内倒位、基因多态性及性染色体异常等[6]。

　　1.1相互易位

　　相互易位是一种常见的染色体结构重排，指两种不同的染色体交换片段。其发生率为1/673～1/1000[7]。平衡相互易位个体在临床表型上是正常的，然而他们的后代受异常染色体减数分裂的干扰发生不平衡染色体核型的风险增加。染色体结构异常夫妇的妊娠产物可以是正常的或染色体平衡易位或染色体不平衡易位。因此，父母染色体若发生断裂，需要检测胚胎的染色体核型以达到精确诊断。

　　1.2罗伯逊易位

　　在染色体异常中，罗伯逊易位是人类染色体中最常见的结构重排，在活胎中发生率为1/1000[8]。罗伯逊易位主要是2条近端着丝粒染色体着丝粒融合导致染色体减少1条。在临床上，罗伯逊易位可分为同源及非同源两种形态。当患者为同源罗伯逊易位携带者时，胚胎染色体只能是单体或者三体形式，在极早期就发生流产；而非同源罗伯逊易位携带者生育表型正常的新生儿的概率为1/3，另2/3胚胎染色体重复或缺失最终导致流产或畸形。

　　1.3倒位

　　倒位是指在同一条染色体上同时发生两次断裂，而断裂片段旋转180°后重新连接至染色体上。当两处断裂发生在一条染色体的一个臂上则为臂内断裂，当两次断裂间包含着丝粒点时则为臂间断裂。染色体臂间倒位的风险与倒位片段的长度有关，臂间倒位的片段越长，形成交叉环的几率越大，产生严重不平衡的配子概率越小从而活产率越高。而臂内倒位的结局比臂间倒位更糟糕。

　　1.4性染色体X染色体失活（Xchromosomeinactivation，XCI）

　　指女性胚胎在早期发育时两条X染色体的其中一条发生转录沉默。除了女性生殖细胞，这个过程发生在几乎所有细胞中，在卵母细胞中其两条X染色体都是有活性的。失活的X染色体经历了组蛋白去乙酰化和去甲基化，然后通过DNA甲基化，继承给所有子细胞。高度扭曲的X染色体失活（highlyskewedXCI，HSXI)是细胞选择的结果，在这些细胞中失活是随机的，选择程度在不同组织类型中有所不同，有几个证据支持此观点：（1）在经产妇中含HSXI细胞的比例比初产妇多，且老年人比生育期妇女多。（2）X-连锁疾病杂合子携带者有时表现出携带该疾病等位基因的X染色体失活。（3）HSXI增加女性X染色体结构异常（缺失或易位）的发生率。一些研究报道表示HSXI增加女性发生复发性流产的风险。而Warburton等[9]研究发现HSXI与复发性流产的发生没有相关性。

　　有报道称Y染色体微缺失的男性将发生X染色体的缺失[10]。7%少精男性患者可发现Y染色体微缺失，Dewan等[11]及Karaer等[12]均报道了Y染色体微缺失与复发性流产存在相关性。而Wettasinghe等表示Y染色体微缺失与复发性流产病因无关，Y染色体微缺失的检测不能作为复发性流产夫妇的常规检查。在人类Y染色体上存在一种特异性的重复序列即DYZ区，其中最主要的串联重复序列为DYZ1，有作者发现DYZ1的完整性及拷贝数改变与Y染色体显微镜长度密切相关，复发性流产女性的病因可能是其丈夫Y染色体中DYZ1拷贝数的增加或减少所导致[13]。其中Y染色体中DYZ1拷贝数的增加导致Y染色体长度大于18号染色体时为大Y染色体，当小于22号染色体时为小Y染色体。在临床上，我们发现大Y染色体与我们女性复发性流产的发生密切相关，而有关小Y染色体的报道较少。

　　1.5基因多态性

　　目前，大量研究调查人类基因多态性与RSA有潜在相关性。RSA是一个重要的临床问题，其发病机制仍不清，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)可作为一种工具，调查遗传变异与疾病易感性的相关性。排除环境因素的影响，基因多态性增加了RSA的风险[14]。有研究报道CYP1A2，CYP17，CYP1A1，MTHFR的基因多态性与RSA的发病有明显相关。然而又有研究发现MTHFR及eNOS的基因多态性与RSA无关，血管生成及凋亡相关基因的低表达与RSA有关，研究发现P53密码子72多态性更易发生RSA，人类腺苷脱氨酶(ADA)基因缺陷将导致体液及细胞免疫的重症联合免疫缺陷综合征。ADA活性在维护正常妊娠时非常重要，故推断妇女中ADAG22A基因多态性可能与RSA有关[15]。细胞凋亡或者细胞程序性死亡与许多正常发育过程相关，然而细胞凋亡相关基因的异常表达也是有害的，可以导致复发性流产的发生。MohammadSeyedhassani等研究[16]发现BAX基因的多态性将导致自发性复发性流产的高敏感。有报道Foxp3基因功能多态性利于URSA的发生[4]。基于目前的研究结果，超过40种基因产物在复发性流产患者中表达有差异，这些基因可能参与调节终止或维持正常妊娠，然而在这些基因中任何一个核苷酸的改变将导致不同产物的表达与激活，从而危害正常妊娠过程。更好地明确遗传背景和这些多态性的重要性将有助于控制妊娠，预防妊娠并发症的发生。

　　RSA与胚胎染色体核型关系

　　早期流产一半以上为胎儿染色体异常所致，细胞遗传学研究发现，这些异常大部分是染色体数目异常（86%），少数为染色体结构异常（6%）及其他如染色体镶嵌现象及亚显微染色体异常等（8%）。这个结果是通过对流产儿常规染色体核型分析所得，真正的发生率可能更高。有5组研究已经对复发性流产的胎儿进行核型分析，其平均流产数为4.12±0.48，胎儿染色体异常率为25%～57%[5]。事实上，当复发性流产其他病因存在时，同样可发现流产儿染色体异常。有报道抗磷脂综合征患者发生胎儿染色体异常率为30%，同时发现4个遗传性血栓形成倾向患者流产儿有染色体异常。而染色体数目异常中最常见的类型为染色体三体，由于母细胞在减数分裂是同源染色体未分离，导致子细胞中染色体的重复或缺失，从而导致染色体三体或单体的存在。流产儿的染色体核型分析能为患者随后的妊娠提供预测意义的信息。大多发生非整倍体流产的患者预后较好，非整倍体流产只会偶然发生，然而少数患者将会复发。由于流产儿的病因经常被忽视而只评估母体因素，所以目前我们仍不能确定复发性流产的病因，也几乎不能给予有效的治疗。双亲染色体核型分析并不能取代胎儿染色体核型分析，因为它不能诊断及预知，更不能指示治疗。在人类妊娠时超声是主要的诊断胎儿结构异常的方法。然而，人类复发性流产89%发生在妊娠前3个月。在这个阶段因为胎儿太小以至于超声不能确定有无畸形。由于未考虑到胚胎的染色体核型畸形，而大部分治疗主要针对母体，如切除宫内隔膜、抑制高乳酸脱氢酶水平，黄体功能不足时补充适当的激素，抗血栓形成及免疫强化，没有足够证据证明其有效。同样，有报道针对胎儿使用孕前非整倍体筛查的形式或植入前遗传诊断（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD)，其结果并不比复发性流产的经验治疗的结果更好。与期待治疗相比PGD并不能提高染色体结构异常夫妇的妊娠结局。然而有人认为在反复胎儿非整倍体及存在夫妇染色体畸形患者中PGD有一定价值，且在高龄产妇中也有一定价值。因此，流产儿进行染色体核型分析对诊断、预后及合适治疗是至关重要的。假如存在反复胎儿因素导致流产，应该考虑使用PGD。

　　染色体核型检测方法

　　复发性流产给患者及临床带来了极大的困难。尽管目前有很多的评估手段，但是仍有大量的复发性流产找不到病因。故可能存在一种传统细胞遗传学分析方法不能发现的亚显微染色体改变能导致流产的发生。传统的核型分析是分析染色体异常的标准，是整个基因组技术的一种。然而，它会受染色体制备过程中母源污染、培养失败、过度生长及质量差等因素影响。另一个缺点是其有限的分辨率。染色体比较基因组杂交（chromosomalcomparativegenomichybridization，CGH)，阵列比较基因组杂交（array-comparativegenomichybridization，array-CGH)，荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH)，多重连接依赖性探针扩增（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)，荧光定量聚合酶链反应（quantitativefluorescentpolymerasechainreaction，QF-PCR)等技术与传统的细胞遗传学技术相比克服了一些缺陷如染色体制片差、培养失败及母细胞污染及分辨率低等。在早期流产中这些技术发现了更多异常情况。这些分子技术可细分为整个基因组技术(chromosomal-CGHandarray-CGH)及染色体技术(FISH，MLPAandQF-PCR)，然而目前为止并无这些技术具体比较的研究。

　　3.1染色体比较

　　基因组杂交CGH可以检测整个基因组中DNA拷贝数的减少或增多，但在中期染色体中分辨率受限制。在临床细胞遗传学中CGH的单独应用有严格的限制，其不能发现多倍性及平衡染色体异常情况，多倍性可以通过FISH或流式细胞分析技术（flowcytometry，FCM）检测。有研究联合应用CGH及FCM对253个自然流产样本进行检测，并与传统核型分析（培养失败）比较多检测出12个染色体异常。这个研究结果表明CGH联合FCM能克服单独使用CGH或核型分析的缺陷[17]。另一项研究是对用核型分析而培养失败的57个样本进行CGH，其中37个样本即65%发现了染色体异常[18]。表明当某种原因导致无法用核型分析时CGH可作为一附加技术应用。

　　3.2阵列比较

　　基因组杂交array-CGH可观察到整个基因组亚显微染色体改变，故与CGH比较array-CGH可检测到更多异常情况。有研究对264个散发流产样本进行array-CGH及传统核型分析比较，染色体异常未检出率为2%∶10%，并且array-CGH可检测出传统核型分析不能发现的亚显微染色体异常[19]。在散发流产样本中，传统核型分析染色体异常检出率为30%而array-CGH为31%；在复发性流产样本中array-CGH的应用价值不明确。当传统核型分析失败时array-CGH可作为附加技术应用。在临床细胞遗传学中array-CGH的单独应用具有明显的局限性，array-CGH联合应用FCM可以克服传统核型分析的局限性。

　　3.3荧光原位杂交

　　FISH是一种映射技术，它通过荧光标记的DNA探针来检测特定DNA片段的存在或缺失。因为FISH对具体基因组片段使用探针技术，故可作为一个附加技术对流产样本进行准确的细胞遗传学评估或确定这个细胞遗传学结果。有研究发现在核型分析失败后FISH可作为一个可靠的技术观察染色体异常。对57个散发流产样本进行FISH及传统核型分析比较，在5个培养失败的样本中4个用FISH检测发现染色体异常；并且有2个核型正常的样本用FISH检测分析其染色体异常，这个可用母源性污染解释[20]。

　　3.4多重连接依赖性探针扩增

　　MLPA是一种多重PCR扩增技术，它可以用一小段DNA（20～200ng）检测50个以上不同基因组DNA片段的异常拷贝。只有少数研究报道了在散发或复发性流产样本中MLPA观察染色体异常的应用。有研究对比了在散发性流产中MLPA与传统核型分析的区别，然而这些研究使用了不同的MLPA装备，故这些数据不能混合[19]。MLPA的缺点主要是不能检测出多倍体，用MLPA检测74个流产样本发现有2个三倍体为假阴性。对284个复发性流产样本进行检测，MLPA的假阴性率为13%，而传统核型分析假阴性率为3%。另外，18%发生核型分析失败，主要是由于培养失败及组织样本的腐败导致。然而MLPA只有1%样本失败，主要是样本质量差及样本数量少导致[21]。故为了防止培养失败，MLPA是一个不错的选择，但是其不能检测到三倍体。如果核型分析未发现异常的样本用带端粒探针的MLPA可分析可发现其中37%有染色体异常。

　　3.5荧光定量聚合酶链反应

　　QF-PCR是指用染色体上DNA多重标记检测不同等位基因的存在。这个检测是通过应用多重短串联重复系列标记对染色体13，18，21，X及Y的非整倍性进行产前及产后诊断。2005年，这个技术首次被应用于评估160个散发流产样本，QF-PCR检测到5个样本为男性染色体导致的流产，而核型分析为女性核型，其主要原因为母源性的过度生长。另外3例核型分析为非整倍体，而QF-PCR显示的是正常女性表型[22]。另一研究对61个散发流产样本及48个对照样本进行QF-PCR检测染色体异常情况，他们用8条最常发生染色体异常的染色体微卫星标志发现36%样本有染色体数量异常，只有两个样本结果与核型分析不一致，核型分析为46XY/46XX核型样本QF-PCR未检测到；另一样本核型分析为46XX，而QF-PCR显示不规则峰[23]。由于QF-PCR技术应用于染色体数目的检测是受限制的，故QF-PCR是否为一可靠技术存在争议。主要缺点是这个技术是对具体染色体进行标记而非整个基因组，所以其成功率主要依靠染色体标记物的使用。很少研究报道关于QF-PCR的使用，故我们需要更多的研究去确定在流产样本中QF-PCR能否单独应用去检测染色体异常情况。QF-PCR与传统核型分析相比优点是快速及相对便宜，与MLPA相比QF-PCR能检测出多倍体。尽管QF-PCR也是一种染色体区域具体技术且临床使用较少及其结果依赖于染色体标记物及探针的使用，但其与传统核型分析一样重要。

　　动物模型的建立与研究

　　在生殖过程中，成千上万个基因相互影响形成一个精细的调节网络，其复杂度限制了我们寻找其功能障碍导致的流产、不孕不育等的分子因素。且在人类临床中，涉及人类生殖缺陷的分子研究挑战了我们的伦理道德标准，故有学者选择动物模型进行研究。然而，尽管已经建立了成千上万个不育或生殖力减低表型的突变小鼠模型，但是导致不育的遗传原因很少被阐明。为了寻找导致胚胎死亡的基因学改变，学者们建立种间重组同基因异系（interspecificrecombinantcongenicstrains，IRCS)小鼠模型，这个模型允许定位于与复杂表型（数量性状基因或数量性状遗传位点）有关的染色体区域[24]。尽管小鼠及人类在怀孕期间胎盘形成体系不完全相同，但其高度相似性足以让我们通过小鼠模型检测涉及人类的基因改变。有人用小鼠模型胚胎发育的方法研究染色体1区(Led2)对胚胎死亡的作用。成功描绘了Led2minA数量性状遗传位点，其对胚胎死亡起了主要的作用；并指出第二个区域Led2minB，其在相同表型上作用更小。通过收集并分析在Led2minAandLed2minB两个区域中基因的表达及作用的实验数据、生物信息学和文献资料，发现在Led2minA区域存在7个基因与表型有关。有关表型基因的确定有必要通过分子生物学方法进一步验证。此研究的主要目的是寻找人类复发性流产有关的新的可能基因；阐明这个多因素参与且复杂的人类疾病的分子基础，并为其诊断提供新的标记物。总之，复发性流产的病因较多且复杂，并仍有50%的患者病因不明。迄今为止，RSA的遗传学病因探索已经取得一定的成功。但我们很难从基因学方面详细分析哺乳动物的生殖表型，因为它们有成千上万个基因相互作用形成调控网络，故限制我们找出大部分复发性流产患者的病因。本文从遗传学方面讲述了复发性流产病因、检测及相关研究，目的是阐明这个多因素参与且复杂的人类疾病的遗传基础，并为其诊断及治疗提供新的方向。